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小麦黄化苗总DNA的提取

小麦黄化苗总DNA的提取

实验原理

小麦黄化苗经液氮研磨,可使细胞壁破裂,加入去污剂(如SDS),可使核蛋白体解析,然后使蛋白和多糖杂质沉淀,DNA进入水相,再用酚、抽提纯化。本实验采用SDS法,其主要作用是破膜。SDS属阴离子去污剂,要溶解膜蛋白与脂肪,也可解聚核蛋白。SDS在溶液中带负电荷,能与带正电荷的蛋白质侧链结合成复合物,当加入钾盐时,能与SDS-蛋白质生成溶解度很小的沉淀一同去除。酚/异戊醇的作用是去除核酸制品中的蛋白质,并有利于水相与有机相的分开,而且可以消除泡沫。异丙醇或乙醇的作用是沉淀DNA。 
处理DNA样品时,可在65℃保温30min,较之37℃处理有以下优点:RNA酶的最适作用温度为65℃;DNA酶最适作用温度为37℃,当用65℃处理时,这些酶往往处于活性极低的状态而不会降解DNA;RNA中的某些总分会形成发卡结构,65℃处理更有利于这些结构的松散,使RNA酶的作用更完全。

实验试剂

1. 提取缓冲液   
   100mmo/L NaCl 
   100mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 
   50mmol/L EDTA 
   1%疏基乙醇 
2. 20%SDS 
3. 5mol/L醋酸钾 
取29.5ml冰醋酸,用KOH颗粒调校至PH4.8,加水至100ml,室温保存,不可灭菌。 
4. 酚/异戊醇(25:24:1) 
5. 异丙醇 
6. 70%乙醇

实验设备

1. 冰盘(4个)

2. 研钵(8套)

3. 塑料烧杯(8个)

4. 200μl微量加样器(2把)

5. 离心机(1台)

6. 水浴锅(65℃)

7. 枪头及EP管

实验材料

小麦黄花苗

实验步骤

1. 称取0.1g小麦黄化苗叶片于预冷的研钵中,加入3倍体积(W/V,约300μl) 提取缓冲液,在冰盘上研磨。 
2. 研碎后转入一EP管中,再加约300μl提取缓冲液。 
3. 加入20%SDS至终浓度为2%,约 66μl。 
4. 轻轻混匀后于65℃水浴,10min。 
5. 加入1/10体积的5mol/L醋酸钾(约66μl),于水浴中反应 30min。 
6. 离心(15krpm,10min,4℃)。 
7. 取上相转入一新的EP管中,用等体积的酚/异戊醇(25:24:1)抽提一次(上下晃动几次即可)。 
8. 离心(12krpm,10min,20℃)。 
9. 取上相转入一新的EP管中,加入等体积的异丙醇,于室温下反应5~10min,其间将管至少颠倒5次。 
10. 离心(15krpm,10min,4℃)。 
11. 弃上清液,用70%乙醇冲洗沉淀物,真空抽干或吹干,最后溶于1×TE中(约50μl)。

注意事项

1. 研磨后应迅速加入提取液,因为提取液中含EDTA,能够螯合Mg等二价阳离子,防止破碎细胞中的DNA酶降解DNA。 
2. 提取过程中,转移上清液时所用的枪头最好用剪刀将尖头剪去,以避免对DNA造成的不必要的机械损伤。 
3. 干燥DNA时,要注意,过干或过湿都不利于DNA的溶解。

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