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细胞的非玻璃化冻存方法

细胞的非玻璃化冻存方法

实验试剂

 

冷冻保护液:一般是以 9 份小牛血清或细胞培养液与 1 份 DMSO 混合而成。现配现用,或配制后防入普通冰箱冰盒内冷冻保存。使用前,于室温下水浴溶解。

实验设备

普通冰箱、-30℃低温冰箱和-70℃~-80℃超低温冰箱、液氮冻存罐、高速离心机、电子计算机程控降温仪等;
冻存管:容量为 1ml 或 1.5ml。

实验材料

待冻存细胞:各种肿瘤细胞或杂交瘤细胞。

实验步骤

 

1. 待冻存细胞悬液的制备

   1) 按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物,制备单细胞悬液,并计算细胞总数;

   2) 将细胞悬液以 800~1000r/min 离心 5min,去上清夜;

   3) 向细胞沉淀物中加入冷冻保护液,轻轻吹打混匀,使细胞密度达 1×106~1×107个/ml;

   4) 按每管 1~1.5ml 的量分装于冻存管内,拧紧管盖;

   5) 再冻存管上做好标记,包括细胞代号及冻存日期。

2. 分级冷冻

   1) 先将冻存管放入普通冰箱冷藏室(4~8℃),约 40min;

   2) 接着将冻存管置于普通冰箱冷冻室(-10℃~-20℃),约 30~60min;

   3) 将冻存管转入低温冰箱(-30℃),放置 30min左右;

   4) 然后将冻存管转移到超低温冰箱(-70℃~-80℃),过夜;

   5) zui后将冻存管投入液氮保存。

3. 记录

做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及操作人员。

注意事项

 

1. 在使用 DMSO 前,不要对其进行高压灭菌,因其本身就有灭菌作用。高压灭菌反而会破坏其分子结构,以致降低冷冻保护效果。在常温下,DMSO 对人体有毒,故在配制时zui好带手套。

2. 在将细胞冻存管投入液氮时,动作要小心、轻巧,以免液氮从液氮罐内溅出。若液氮溅出,可能对皮肤造成冻伤。操作过程中zui好带防冻手套、面罩、工作衣或防冻鞋。

3. 应注意控制冻存细胞的质量。既要在冻存前保障细胞具有高活力,还要确保无微生物污染,这样的细胞才具有冻存价值。另外,在每批细胞冻存一段时间后,要复苏 1~2 管,以观察其活力以及是否受到微生物的污染。

4. 冻存管宜采用塑料冻存管,不宜使用玻璃安瓿。因为在复苏时,需要从-196℃的液氮中取出冻存管,立即投入 37~40℃温水中,温差很大,玻璃安瓿瓶容易爆炸而发生危险。

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