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蛋白质纯化胶体过滤法

蛋白质纯化胶体过滤法

实验试剂

1. 胶体Sephacryl S-300 (Pharmacia):a. 预先以缓冲液buffer A-150 平衡好,并且使完全沉降后的胶体体积,占全部体积的七至八成;要先预估好胶体的使用?。b. 胶体温?要与操作场所的温?一致,否则温?变化会产生气泡。c. Sephacryl 系?胶体有相当大的吸附?,因此要在缓冲液加入0.15 M 以上的NaCl 以除去非专一性吸附。

2. Buffer A-150:注意使用时的温?要与管柱胶体的温?一致。

3. 标准分子?组合 (Bio-Rad 151-1901):溶于1 mL 后每组取0.4 mL。含有thyroglobulin (670 kD), bovine gamma globulin (158 kD), chicken ovalbumin (44 kD), equine myoglobin (17 kD), vitamin B12 (1,350

实验设备

 

色析管柱 (Pharmacia C column, 1.6×100 cm)、铁架、铁夹及水平仪;分划收集器 (fraction collector, 需准备干净试管约100 支);浓缩用离心机 (低速5,000 rpm);浓缩用离心管Centriprep-30 (Amicon 4322)

实验步骤

管柱装填:

1. 以纯水冲洗玻璃管柱 (以纯水上下冲洗即可,严禁使用试管刷);?解管柱的构造与拆装方法,垂直架好管柱,以软管连接分划收集器,并以bufferA-150 试看管?是否通畅;可以用止血钳或长尾文书夹夹住出口软管,则可控制溶离的进?。注意系统的摆设要适当,?要装置于交通要塞。

2. 依预估?取出Sephacryl 胶体,注意胶体的温?与缓冲液是否已平衡;将瓶中的胶体上下震荡,使的完全悬浮,但勿产生太多气泡。

3. 在管柱内加入约10 cm 高缓冲液,然后将胶体慢慢沿着管壁倒入管柱,一直加到管柱顶端,开始?洗后胶体沉降很快。当胶体上方的液面逐渐?低时,可于顶端添加胶体,以达所要高?;胶体高?约90 cm。

4. 胶体完全沉降后,小心以buffer A-150加满管柱,关闭出口,装上顶端端盖并连通缓冲液瓶,打开出口以重??洗。调整缓冲液瓶高?,使?速约每五~?秒一滴,并设定收集体积为2.5 mL/tube。

5. 胶柱?洗约100 mL 后,关闭出口,拆开顶端端盖,先以滴管吸出胶体上方的溶液到剩约1 cm 高,注意勿破坏胶体表面平整;然后打开出口,使液面下?至胶体面,再关闭出口,准备注入样本。

样本色析进?:

6. 以微?移液器或滴管吸取样本 (样本体积?得超过胶体总体积的3%),沿着胶体上方管壁缓慢加入,注意切勿破坏胶体的平整表面!(样本确实体积 _______ mL)

7. 打开出口,同时开启分划收集器;当样本完全没入胶体时,关闭出口,缓缓加入与样本相等体积的buffer A-150,打开出口待其慢慢进入胶体中,如此重复二次。?得扰动胶体表面,造成凹陷。

8. 暂时关闭出口,将液面高?加满至管柱顶端,并把顶端端盖锁上;然后打开出口开始溶离,调整缓冲液瓶的高?,使?速为6s一滴。

9. ?心观察前面几个分划,确定整个系统运转无碍,小心分划收集器最容?出问题。管柱预计将?洗过夜,收集约80管。

10. 收集分划试管,进?蛋白质定?分析以及GUS 活性测定,作图。

11. 收集GUS 活性区,以Centriprep-30浓缩至10 mL后,加buffer A-0稀释至20 mL,再次浓缩至_______ mL (GF),保?100 μL。

12. 管柱请再以buffer A-150?洗100 mL后,小心放置一旁,准备以后进?分子?测定。

分子?测定:

13. 进?分子?测定前一天,请先以buffer A-150?洗100 mL,并检查胶柱内有无气泡产生,?有严重的气泡或干?,必须重新装填管柱。

14. 取标准分子?溶液0.4 mL,加上纯质目标酶0.5 mL (以亲和层析法所得的AF 部份),如上法注入管柱中,?刻开始进?胶体过滤,并收集各分划。依循上述所有管柱及分划收集器的操作要点。

15. 收集所得的各分划,进?蛋白质定?分析,可定出数个蛋白质尖峰,以作为分子?依据;另以目测法,决定红色高峰的管数,则可定出vitamin B12的溶离管数。?用以上数据,可画出分子?与溶离管数间的直线关系,作为分子?判定的标准校正线。

16. 同样的一批分划,进?酶活性分析 (GUS),则可定出酶的溶离体积,对照上述标准校正线,则可求出酶的分子?。

拆除管柱及保存胶体:

17. ?管柱长期?用,应当自管柱中取出胶体,以缓冲液清洗后,置冷藏室中保存,但绝对?要放在冷冻箱中。胶体?装填太紧,有时可能??取出,要有耐心地以缓冲液慢慢冲出来。

 18. 胶体可以加0.01% NaN3防止霉菌生长,但使用前记得要洗去;再?使用时要检查胶体中有无灰黑色霉菌颗?,?有结块而??打散者,不能使用。

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