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ELISA试剂盒实验操作步骤解析

ELISA试剂盒实验操作步骤解析

ELISA检测以灵敏度较高、特异性较好等特点在食品安全检测中得到广泛的应用,但在操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大。如不注意,有可能导致显色不完全、花板、检测无效等结果。所以实验过程中应注意选择质量优良的检测试剂,严格按照试剂说明书进行操作。在ELISA操作过程中,同时做好室内质控、室间质评,认真做好各项检验记录,才能保证ELISA检测质量。
一、样品的保存
    用于ELSIA检测的样本非常广泛,包括各种动物组织、动物体液以及其他食品提取物等。有些样本可以直接通过简单离心、稀释,有些则需要经过理化方法进行提取。检测样品应保证新鲜,经前处理的提取液应及时进行检测,时间越长,提取液中的抗原的效价越低。如不及时检测,应及时放4℃冰箱保存。防止细菌污染,因菌体中可能含有内源性HRP,可能会导致假阳性反应。如在冰箱中保存过久,其中的HRP可能发生聚合,在间接法ELSIA检测中可使本底加深。所以标本如需保存做多次检测,宜采用少量分装冰箱保存。组织样本若不及时做处理,应该放置-15℃冰箱保存。

二、试剂的准备
    严格按照试剂盒的说明书的要求准备好需要用到的试剂。LEISA检测中应采用蒸馏水或者去离子水,洗涤用水应新鲜和高质量,注意查看是否需要和洗涤液进行稀释。自配的缓冲液应用PH计测量校正。从冰箱取出的试剂必须与室温平衡方可使用。试剂盒中本次试验不需要的试剂部分及时放回冰箱保存。

三、加样
    在ELSIA加样步骤中,应加所加物加到ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可溅出,不可产生气泡。加标本一般使用微量加样器,按规定的量加入孔板中。每次加标本必须更换枪头,以免交叉污染。加酶标记物和底物液时可用定量多道加样器,使加样过程迅速完成。
四、温育
    温育的方式一般采用水浴,可将酶标板置于水浴箱中,酶标板底贴着水面,是温度迅速平衡。为避免蒸发,酶标板上应加盖,也可用塑料贴封或者保鲜膜覆盖板孔,此时可让反应板漂浮在水面上。若保温箱,酶标板应放在湿盒内,湿盒要选用传热性能良好的材料或者如金属等,在盒底垫湿的纱布,zui好将酶标板放在纱布上。这样能保证稳定迅速平衡。无论水浴还是湿盒温育,反应板均不宜叠放,以保证各板的温度能迅速平衡。室温温育的反应,操作时的室温要严格限制在室温的范围内,标准室温温度是指20℃-25℃,具体的操作时间根据说明书的要求严格控制温育。
五、洗涤
    洗涤在ELISA过程中虽然不是一个反应步骤,但是却决定着实验的成败,ELSIA反应就是靠洗涤来达到将游离和结合的酶标记物分离的目的。通过洗涤来清洗掉残留在酶标板是未能与固相抗原或抗体结合的物质,已经在反应过程中非常特异性地吸附于固相载体上的干扰物质。聚苯乙烯等塑料材料对蛋白质的吸附石普遍性的,而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELSIA操作过程中,洗涤是主要的关键技术,每一次清洗都必须谨慎进行,操作者应严格按照要求进行洗涤。清洗的方式有手工清洗和洗板机自动清洗两种。下面主要介绍手工清洗方式。
      1、吸干或者甩干孔内反应液
      2、用洗涤液洗一遍。(将洗涤液注满板孔后,即甩去)
      3、浸泡,将洗涤液注满酶标孔,放置1-2min,间歇摇动,浸泡时间不可随意缩短。
      4、甩掉孔内液体,用清洁毛巾或者吸水纸拍干。
      5、重复3和4步骤,洗涤4次。
六、显色和比色
    显色是ELSIA中的zui后一个温育步骤,此时酶催化无色底物生产有色产物。反应的温度和时间仍是影响显色的zui重要的因素。加入底物后的反应时间和温度应该按规定严格控制准确。
七、酶标仪读板
    测读吸光度值时,要选用产物的敏感吸收峰。有的酶标仪可用双波长读数,即每孔先后读两次,*次在zui适合波长,第二次在不敏感的波长,两次测读不移动酶标板的位置。zui终读数得到值为两者之差,即敏感波长值减去不敏感波长值。双波长读数可以减少由容器壁划痕或指纹造成的光干扰。
八、结果判定
    根据实验读数,结果产品说明进行结果判定。

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